agata kamińska kraków

Osoby z prawidłową neurologiczną i hematologiczną historią, badanie neurologiczne, analizę morfologii erytrocytu, o ile było dostępne (patrz poniżej), uważano za niewrażliwe. Wszystkie procedury były zgodne z Konwencją Helsińską i zostały zatwierdzone przez Komitety Etyczne Uniwersytetu w Ulm, Uniwersytetu w Tybindze, Uniwersytetu w Bari, Narodowego Szpitala Neurologii i Neurochirurgii oraz Instytutu Badań w Neurologii. Kliniczne cechy rodzin PED2. 4 opisano wcześniej (24. 26). Analiza morfologii erytrocytów. Wszystkie procedury przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (18). Świeże próbki krwi (5 ml) natychmiast mieszano z taką samą ilością izotonicznego roztworu NaCl, zawierającego 10 jednostek heparyny na ml. Po 1-2 godzinach kroplę mieszaniny umieszczono pomiędzy szkiełkiem przedmiotowym a szklanym szkiełkiem nakrywkowym i zbadano za pomocą mikroskopii świetlnej z kontrastem fazowym z powiększeniem x 1000 (zanurzenie w oleju). Zliczono pięćset erytrocytów i obliczono odsetek zdeformowanych komórek. Wszystkie czerwone krwinki z kolcami odpowiadającymi akantocytom typu AI / AII i echinocytom w klasyfikacji Redmana (37. 39) zostały uznane za zdeformowane (18) i sklasyfikowane jako echinocyty ujawnione za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (39). Ilości echinocytów wyrażono jako procent wszystkich erytrocytów. Stosując tę metodę, normalny zakres echinocytów wynosi mniej niż 6,3% wszystkich erytrocytów (99. percentyl 132 zdrowych i kontroli choroby), ze swoistością 0,98 i czułością w wykrywaniu echinocytozy / akantocytozy w genetycznie potwierdzonej choreo-akantocytozie 1,0 ( 18). Ta analiza morfologiczna została przeprowadzona w rodzinach PED1, PED3 i PED5. Świeże próbki krwi nie były dostępne dla rodzin PED2 i PED4. W przypadku skaningowej mikroskopii elektronowej próbki przygotowano w taki sam sposób jak opisano powyżej dla mikroskopii świetlnej, a następnie utrwalono przez dodanie 2,5% aldehydu glutarowego. Odwodnienie przeprowadzono stosując stopione alkohole i suszarkę punktową (Bal-Tec). Próbki zacieniono platyną (Bal-Tec) i zbadano w skaningowym mikroskopie elektronowym (DSM 962, Carl-Zeiss) przy 10 kV. Oznaczanie wewnątrzkomórkowych stężeń jonowych w erytrocytach. Próbki krwi pobrane od pacjentów z EDTA i normalne kontrole pobrano w tym samym dniu i wysłano do naszego laboratorium na noc. Kilka mililitrów krwi wirowano przez 10 minut przy 2000 g. Erytrocyty przemyto 3 razy 10 ml chlorku choliny (150 mM), odwirowano po każdym etapie przemywania, a supernatant odrzucono. Przemyte erytrocyty poddano lizie w 3 alternatywnych etapach zamrażania w ciekłym azocie i rozmrażaniu w łaźni wodnej w temperaturze 80 ° C, a następnie wirowaniu przez godzinę przy 3500 g. Supernatant przeniesiono do 1,5 ml fiolek Eppendorfa i ponownie wirowano przez godzinę przy 5000 g. Porcje supernatantu analizowano za pomocą analizatora chemicznego Dimension RxL (Dade Behring), stosując program moczu w celu oznaczenia [Na +] i oraz [K +] i w erytrocytach. Aby ocenić wpływ zewnętrznej glukozy na [Na +] i [K +] i, surowicę usunięto i wymieniono na wolny od Ca roztwór elektrolitu zawierający 0 lub 15 mM glukozy (138 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 5,4 mM KCl, mM MgCl2 i 10 mM HEPES, pH 7,4). Po 2 godzinach na wytrząsarce przystąpiliśmy do etapów płukania, jak opisano powyżej. Analizę genetyczną, mutagenezę i przygotowanie RNA, przygotowanie oocytu i iniekcję, eksperymenty wychwytu w erytrocytach i oocytach z zastosowaniem znakowanych radioaktywnie glukozy i 86Rb +, western blot i immunocytochemii przeprowadzono standardowymi procedurami opisanymi w Supplemental Methods. Oznaczanie [Na +] i oraz [K +] i w oocytach. Oocyty, którym wstrzyknięto równe ilości cRNA dla transporterów WT lub zmutowanych GLUT1 lub z wodą jako kontrolą, trzymano przez noc w zmodyfikowanym roztworze Barth a Specyficzne blokery ATPazy Na + / K + i Na + / K + / 2Cl. odpowiednio kotransporter, 0,5 mM ouabain i 5 M bumetanid zostały dodane następnego dnia. Nagrania przeprowadzono równolegle dla transporterów zmutowanych i WT, a także dla oocytów z wstrzykniętą wodą w dniu 3 po wstrzyknięciu. [Na +] i oraz [K +] i my
[przypisy: za krótkie wędzidełko, tibia windbot, olx bystrzyca kłodzka ]