badania prenatalne kraków kopernika

Nie jest jasne, czy dysocjacja białka 60 kDa z ludzkiego RNA wymaga udziału innych białek. Komórkowych funkcji antygenów SS-A / Ro nie scharakteryzowano. Ponieważ istnieje bezpośrednie oddziaływanie między 60-kDa SS-A / Ro i RNA hY przy użyciu eksperymentów immunoprecypitacji, postulowano, że białko 60 kDa uczestniczy w biogenezie ludzkiego RNA. Proponuje się także, aby białko o masie 60 kDa działało jako część nowej kontroli jakości lub ścieżki odrzucania prekursorów rRNA 5S w oocytach Xenopus (16). Jednakże, ponieważ nie wiadomo, aby RNA 5S był związany z SS-A / Ro o masie 60 kDa w komórkach ssaków, funkcja białka SS-A / Ro u ssaków pozostaje wyjaśniona. W związku z tym rozpoczęto identyfikację znanych lub nowych białek komórkowych, które fizycznie oddziałują z antygenem SS-A / Ro o masie 60 kDa, aby uzyskać wgląd w komórkową funkcję SS-A / Ro i jej potencjalną rolę w patogenezie NLE. Jest możliwe, że antygeny SS-A / Ro tworzą kompleksy z innymi składnikami komórkowymi, które uczestniczą w wyzwalaniu tworzenia się autoprzeciwciał. W badaniu tym skoncentrowano się na 60 (3, ponieważ jest to główna forma wyrażana w komórkach ludzkich, i zastosowano drożdżowe i ssacze 2-hybrydowe systemy z biochemicznym potwierdzeniem interakcji białek. Metody 2-hybrydowe klonowanie drożdży. Ludzką bibliotekę cDNA keratynocytów napletka zbudowaną z drożdżowym 2-hybrydowym wektorem pGAD10 zakupiono od firmy CLONTECH Laboratories Inc. (nr katalogowy HL4034AB, Palo Alto, Kalifornia, USA) i stosowano do badania przesiewowego docelowych białek związanych z SS-A 60 kDa / Ro. Plazmid przynęty skonstruowano z domeną wiążącą DNA GAL4 (GAL4-DB) skoniugowaną z aminokwasami 165 538 białka SS-A / Ro o masie 60 kDa przy użyciu wektora plazmidowego pBD-GAL4 Cam z systemu klonowania Stratagene (La Jolla). , Kalifornia, USA). Ponieważ białko SS-A / Ro o długości 60 kDa (538 aminokwasów) ma domenę wiążącą RNA (aa60. 160) w regionie końca NH2 (6, 11), uzasadnienie projektu konstruktu przynęty do identyfikacji partnerem interakcji białek było to, że domena wiążąca RNA powinna być wykluczona w celu zmniejszenia tła w drożdżowym 2-hybrydowym systemie klonowania. Około 1,9 miliona cDNA kotransformowano razem z przynętą do szczepu drożdży YRG-2 i wysiano na pożywce z potrójnym niedoborem aminokwasu (podłoże His / Leu / Trp) zgodnie z protokołem przesiewowym biblioteki dostarczonym przez CLONTECH. Plazmidowy DNA z 3 pozytywnych klonów drożdżowych ekstrahowano i transformowano do Escherichia coli XL-1 Blue, wybranych do antybiotykowej ampicyliny (50 .g / ml). Izolacja 5. sekwencja cDNA pp75 przy użyciu 5. RACE i hybrydyzacja z biblioteką WI38. Ponieważ cDNA otrzymany z drożdżowego układu 2-hybrydowego był częściową sekwencją, zastosowano metodologię RACE w celu uzyskania nakładających się 5. klony z cDNA ludzkiej łożyska (cDNA o gotowości 5 RACE-Ready, CLONTECH). Ponadto, ludzką bibliotekę WIU biblioteki fibroblastów zbudowaną w wektorze. Zap II zakupiono ze Stratagene i przeszukiwano za pomocą sondy oligonukleotydowej opartej na 5. sekwencja wstawki cDNA pAD. Dwa częściowo komplementarne syntetyczne oligonukleotydy: 5. CTAAGTCGGAGCGAGTTGGGTCGCCGAAGCTCTCTGGGGG-3. 5. CCCAGGATGGGACCCCCCTTTTCCCCCAGAGAGCTTCGGC-3. zostały zaprojektowane (podkreślenie zachodzące na siebie), zsyntetyzowane za pomocą syntetyzatora model 394 Applied Biosystems Inc. (Foster City, Kalifornia, USA), zmieszane w równomolowych ilościach, znakowane. – [32P] dATP z zastosowaniem reakcji wypełniania polimerem Klenowa i oczyszczone do zastosowania w badanie hybrydyzacyjne biblioteki cDNA przy użyciu standardowych metod (17). Pozytywne klony zidentyfikowano po oczyszczeniu łysinek i subklonowano in vivo do plazmidu pBluescript przy użyciu faga pomocniczego R408. Analiza sekwencji. Sekwencje nukleotydowe określono w obu niciach przy użyciu sekwencjonowania terminatora barwnika i półautomatycznego sekwencera Applied Biosystems 377 i kompilowano przy użyciu oprogramowania SeqEd (Applied Biosystems, Inc.)
[hasła pokrewne: zespół fallota, windbot skrypty, zespół pradera williego ]