Gorączki u dziecka

Związek dubletu pp64 i pp75 nie jest dalej badany w niniejszym badaniu, ale pozostaje obszarem aktywnego badania w naszym laboratorium. Figura 2 Zachodni blot i immunoprecypitacja pp75. (a) Analiza Western blot lizatu całych komórek HeLa z użyciem preimmunizacji (ścieżki i 3) i surowic odpornościowych (ścieżki 2 i 4) z królika R2808 (ścieżki i 2) i R2809 (ścieżki 3 i 4). Obie surowice odpornościowe królika rozpoznawały głównie pojedyncze białko o masie 75 kDa (strzałka). (b) Immunoprecypitacja ekstraktu komórkowego z [31P] wyznakowanych fosforanem komórek HeLa przy użyciu surowicy odpornościowej królika (ścieżki i 2), króliczego anty-pp75 z R2809 (linia 3) i R2808 (linia 4), surowicy SS w surowicy z przeciwciałem do SS-A / Ro i SS-B / La (linia 5) i normalna kontrola surowicy ludzkiej (linia 6). SS-A / Ro (Ro60) o 60 kDa jest słabo fosforylowane i nie jest wykrywany w tym teście. W powtórzonych doświadczeniach obie królicze surowice odpornościowe rozpoznały fosfoproteinę 75 kDa (pp75) i dublet 64 kDa (pp64), a surowica od R2809 również rozpoznała 90-kDa fosfoproteinę (pp90), podczas gdy prążki o wyższym ciężarze cząsteczkowym obserwowano na ścieżkach 3 i 4 nie są konsekwentnie przestrzegane. Interakcja między 60-kDa SS-A / Ro i białkiem pp75 w układzie ssaków. Aby uzasadnić dalej biologiczną. Autentyczność. interakcji białko-białko wykryte w systemie drożdżowym, przynęcie 60-kDa SS-A / Ro i docelowy cDNA pp75 zostały subklonowane w ramce odpowiednio do plazmidów eukariotycznych pM i pVP16. Figura 3 pokazuje wyniki, gdy te plazmidy plus kontrole kotransfekowano do komórek COS-7. Plazmid przynęty zawierający 60-kDa SS-A / Ro (pM-60) plus pusty wektor docelowy pVP16 dał sygnał lucyferazy w tle 2,1 x 104 RLU (pM-60 + pVP16). Dla uproszczenia kontrola pojedynczego przynęty lub plazmidu docelowego kotransfekowanego reporterem pGAL-TK-LUX dała ten sam poziom odczytu tła i nie jest pokazana na Figurze 3. Inne negatywne kontrole przedstawione na Figurze 2 obejmują białko p53 jako przynętę i niespokrewniony cel kontrolny ( pM-53 + pVP-CP: 4 x 104 RLU) i pusty wektor przynęty i potencjalny cel pp75 (pM + pVP-75: 3,1 x 104 RLU). Pozytywna kontrola pM3-VP16 składająca się z zarówno białka fuzyjnego domeny aktywacyjnej GAL4, jak i domeny aktywacyjnej VP16 dała 2,0 x 107 RLU, co stanowi 1000-krotnie wyższy sygnał niż negatywne kontrole. Kontrola pozytywna niefuzji reprezentująca oddziaływanie dużego antygenu T p53 i SV40 osobno dała 10-krotnie wyższy sygnał (pM-53 + pVP-T: 2,3 x 105 RLU) niż negatywne kontrole. Co ciekawe, oddziaływanie SS-A / Ro 60 kDa i pp75 dało 100-krotnie wyższy sygnał niż negatywna kontrola i 13-krotnie wyższy sygnał niż pozytywna kontrola interakcji dużych T p53 i SV40 (pM-60 + pVP -75: 3 x 106 RLU). Odpowiednio, interakcja białko-białko 60-kDa SS-A / Ro i pp75 wykryta w klonowaniu drożdżowym 2-hybrydowym może być powtarzalnie potwierdzona w układzie ssaczym. Figura 3 Test dwóch hybryd potwierdził interakcję 60-kDa SS-A / Ro i pp75 w komórkach COS-7. CDNA SS-A / Ro i pp75 60-kDa subklonowano do ssaczego wektora ekspresyjnego pM i pVP16, odpowiednio, jak opisano w Methods. Plazmidy przynęt i docelowe w różnych kombinacjach z pozytywną i negatywną kontrolą kotransfekowano razem z trzecim plazmidem reporterowym pGAL-TK-LUX do komórek COS-7. Po inkubacji przez noc, transfekowane komórki zebrano i lizaty komórkowe analizowano pod względem aktywności lucyferazy i wyrażano jako RLU. Interakcja między SS-A / Ro 60 kDa i pp75 (pM-60 + pVP-75, 3,0 x 106 RLU) była 13-krotnie wyższa niż w przypadku pozytywnej kontroli interakcji pomiędzy dużym antygenem T p53 a SV40 (pM-53 + pVP -T, 2,3 × 105 RLU) i około 100-krotnie wyższe niż sygnały tła w zakresie od 2,1 × 104 do 4 × 104 RLU z różnych kontroli negatywnych
[więcej w: olx bystrzyca kłodzka, zespół mielodysplastyczny, zakrzepica leczenie ]