jeżówki forum

Sekwencję nukleotydową 3,017 zasad dla cDNA WI38 przedłożono do GenBank pod numerem dostępu AF153085. Sekwencje nukleotydowe odpowiadające ORF pomiędzy sekwencją zgłoszoną pod AF153085 i klonem KIAA0857 są identyczne; 4 substytucje pojedynczej zasady i insercja / delecja są obserwowane w 3. nieprzetłumaczone regiony. Miejsce startowe metioniny (sekwencja Kozak. CCGCCATGG) i sygnał poli-A AATAAA są podkreślone. Bogaty w GC 5 -nieulegający translacji region jest podświetlony grubym podkreśleniem 5 lub więcej kolejnych reszt GC. Białko ma stosunkowo wysoki procent reszt seryny (13,94%, pogrubiona i kursywa). Motyw suwaka leucynowego jest podwójnie podkreślony, a 4 leucyny są otoczone kółkiem. Startery RT-PCR i sonda antysensownego RNA do analizy ekspresji mRNA w różnych komórkach i tkankach wskazano strzałkami w obu panelach. Miejsce BamHI użyte do wygenerowania antysensownej sondy RNA jest umieszczone w b. Ekspresja rekombinowanego pp75 w E. coli i wytwarzanie króliczego przeciwciała anty-pp75. CDNA w oryginalnym pINP1 (aa465. 653) i pWI38 (aa105. 653) wklonowano do wektora ekspresyjnego pET28 (Novagen) i transformowano do E. coli BL-21 (DE3) do produkcji rekombinowanego białka. Wektor pET28 wytwarza znacznik fuzji histydynowej na końcu NH2, aby umożliwić wydajne oczyszczanie rekombinowanych białek przy użyciu chromatografii powinowactwa Ni2 + (QIAGEN Inc., Valencia, California, USA). Dwa samice królików nowozelandzkich, białe samice R2808 i R2809 immunizowano przez podskórne iniekcje mg oczyszczonego rekombinowanego pp75 (aa465. 653) w równej objętości CFA (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA). Po 30 dniach zwierzęta stymulowano mg tego samego rekombinowanego białka w niekompletnym adiuwancie Freunda (Difco Laboratories). Antysurowice zebrano 10 dni później i testowano pod kątem specyficznego przeciwciała. Przed immunizacją surowicę preimmunizacyjną zebrano i zastosowano jako kontrole negatywne. Aktywność surowic odpornościowych monitorowano za pomocą testu Western blot i immunofluorescencji. Western blot. Ekstrakty komórkowe lub rekombinowane białka oddzielono 15% żelu poliakryloamidowym, a następnie elektropransferowano do papieru nitrocelulozowego (27). Ludzkie lub królicze surowice rozcieńczone 1: 100 <1000 inkubowano z nitrocelulozą przez godzinę. Po płukaniu buforem nitrocelulozę sondowano przez godzinę kozią przeciwciałem anty-ludzkim IgG sprzężonym z peroksydazą chrzanową lub kozim anty-króliczym IgG rozcieńczonym 1: 2000 ~ 5000. Reaktywności wykrywano metodą chemiluminescencyjną przy użyciu odczynników ECL (Amersham Life Sciences, Buckinghamshire, Wielka Brytania), jak opisano poprzednio (27). Test ELISA anty-pp75. Standardowy test ELISA przeprowadzono zgodnie z ustaloną metodą opisaną powyżej (28). W skrócie, płytkę do mikromiareczkowania o wysokiej zawartości Immulon 2 (Dynex Technologies, Inc., Chantilly, Virginia, USA) powleczono rekombinowanym białkiem o oczyszczonym powinowactwie do kolumny Ni (1 ug / ml) rozcieńczonym w PBS. Ludzkie surowice uzyskano z rejestru badań dla tocznia nowonarodzeniowego (29) i banku surowicy w centrum chorób autoimmunologicznych WM Keck. Surowice rozcieńczone w proporcji 1: 200 inkubowano z antygenem, a związane przeciwciała wykrywano kozią przeciwciałem anty-ludzkim IgG sprzężonym z peroksydazą chrzanową (Caltag Laboratories, South San Francisco, Kalifornia, USA) i substratem 2,2 (3azinobis (3-etylobenztiazolina). kwas sulfonowy) (Boehringer Mannheim Corp.). Przejściowa transfekcja rekombinowanego pp75. Region kodujący cDNA pp75 subklonowano do wektora plazmidowego pCMV-T7Tag skonstruowanego tak, że eksprymowane białko jest w ramce z wyższym znacznikiem 11-aminokwasów-epitopu (T7Tag, Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln- Gln-Met-Gly-Arg) i transkrypcja jest kierowana przez wzmacniacz ludzkiego wirusa cytomegalii (CMV), promotor i elementy intronu [podobne: zaburzenia somatyczne, zespół lyncha, windbot skrypty ]