kiepury 12 leszno

Komórki HeLa hodowano i znakowano radioaktywnie przez noc za pomocą [35S] metioniny lub [32P] ortofosforanu, jak opisano poprzednio (23). Ekstrakty komórkowe przygotowano stosując bufor A (10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,5% Nonidet P-40) lub bufor B zawierający wiele inhibitorów fosfatazy (30 mM Tris-HCl [pH 7,5 ], 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 1,2% glicerol, mM wanadan sodu, 2,5 mM pirofosforan sodu, 50 mM NaF, mM DTT) zawierający kompletny koktajl inhibitora proteazy (Boehringer Mannheim, Corp.). Standardowa reakcja immunoprecypitacji zawierała 100. L 10% białka A-Sepharose, 500. L buforu NET2 (50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5% Nonidet P-40, 0,5% kwasu dezoksycholowego 0,1% SDS, 0,02% azydek sodu), 10 ul 10 mg / ml BSA, 40 ul wyznakowanego ekstraktu komórkowego, 5. 15 l surowicy i inhibitorów proteazy. Po inkubacji przez godzinę, perełki przemywano 5 razy w NET2, eluowano w równej objętości buforu do próbek Laemmli (24), eluowano w 12,5% żelu poliakryloamidowym i poddawano działaniu filmu rentgenowskiego w temperaturze <70 ° C. Analiza metodą Northern blot ekspresji mRNA. Tkanka wielokrotna Northern blot z 2 .g wybranego mRNA poli-A na każdej ścieżce zakupiono od firmy CLONTECH. Sonda antysensownego RNA znakowana [32P] UTP1 o 231 zasadach została poddana transkrypcji z linearyzowanego szablonu DNA BamHI i oczyszczona przy użyciu 6% żelu poliakrylamidowego w 7M moczniku (17). Błot inkubowano wstępnie w buforze do hybrydyzacji ExpressHyb (CLONTECH) w 68 ° C przez 30 minut, a następnie dodano sondę RNA w x 106 cpm / ml przez 60 minut. Blot przemyto i poddano działaniu filmu rentgenowskiego w temperaturze <70 ° C. Aby potwierdzić dokładność załadowanych próbek, tę samą blotkę później usunięto i powtórzono sondą aktynową zgodnie z instrukcjami producenta. Analiza ekspresji mRNA metodą RT-PCR. Drugie do czwartego pasażowania ludzkich keratynocytów z napletków noworodków uzyskano z Clonetics (San Diego, Kalifornia, USA) i hodowano jak opisano wcześniej (25). Inne ludzkie linie komórkowe uzyskano do analizy z American Tissue Culture Collection (Rockville, Maryland, USA), w tym ostrej białaczki limfoblastycznej MOLT-4, raka płuc SK-LU-1 i Calu-3, krtani ropnej HEp-2, piersi rak T47D, rak pęcherza moczowego T24 i rak nabłonka szyjki macicy HeLa. W przypadku linii komórkowych hodowanych jako monowarstwy, komórki zebrano z kolb hodowlanych za pomocą trypsyny i całkowite komórkowe RNA oczyszczono przy użyciu odczynników do izolacji UltrospecRNA (Biotecx, Houston, Texas, USA). Specyficzny mRNA analizowano za pomocą uproszczonej metody RT-PCR opisanej poprzednio (26). Całkowite RNA (0,2 g) i 0,5. M starterów (po 0,5. L) ogrzewano do 70 ° C przez 10 minut, a następnie szybko schłodzono na lodzie. Pozostałe składniki, w tym polimeraza Taq 1.25U (GIBCO BRL), 100N SuperScript II RNaza H-RT (GIBCO BRL), inhibitor 20N RNazy (Promega Corp.), 0.25. L 10 mM dNTP i 2,5. L 10X bufor PCR zawierający Dodano 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl2 i 0,1% żelatyny do całkowitej objętości całkowitej wynoszącej 25 l. Do wykrywania RT-PCR mRNA pp75, primer sensowny 5a-CTGGGAGCATTCAGCCTGTGA-3. i starter antysensowny 5a-ACATTGGAGGTGGTCAAGAG-3. zostały zaprojektowane w oparciu o sekwencję opisaną na fig. 1, z oczekiwanymi produktami PCR o 1041 bp. Wszystkie składniki reakcji zmieszano w pojedynczej probówce do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml przed cyklem termicznym. Program RT-PCR składał się z etapu RT (50 ° C przez godzinę) i etapu denaturacji (94 ° C przez 3 minuty), a następnie 30 cykli PCR (94 ° C przez 5 sekund, 55 ° C przez 5 sekundy i 72 ° C przez minutę). Produkty RT-PCR analizowano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. MRNA genu metabolizmu podstawowego kodującego GAPDH analizowano jako kontrolę wewnętrzną (10 ng całkowitego RNA na reakcję). Figura Clonowanie ludzkiego białka związanego z SS-A / Ro. 60 kDa pp75 [więcej w: olx radziejów, za krótkie wędzidełko, zespół pradera williego ]