kukuła laryngolog strzelno

Zarówno nukleotydowe, jak i wydedukowane sekwencje aminokwasowe analizowano pod kątem podobieństwa ze znanymi sekwencjami przy użyciu przeszukiwania BLAST (18) i ExPASy Proteomics (19). Mammalian 2-hybrydowy system. Zestaw 2-hybrydowy testowy Matchmaker oparty na reporterze CAT otrzymano od firmy CLONTECH. Podobnie jak w drożdżowym systemie 2-hybrydowym, pierwszy ssaczny wektor pM koduje GAL4-DB zaprojektowany do generowania białka fuzyjnego z przynętą. polipeptyd. Drugi wektor ssaczy pVP16 koduje domenę aktywacyjną (AD) pochodzącą z białka VP16 wirusa opryszczki pospolitej i jest zaprojektowana do ekspresji białka fuzyjnego związanego z a targetem. polipeptyd. CDNA SS-A / Ro i pp75 o długości 60 kDa subklonowano z drożdżowych konstruktów ekspresyjnych do ssaczych wektorów ekspresyjnych pM i pVP16 w celu wytworzenia odpowiednio pM-60 (przynęta) i pVP-75 (cel). Wydajność ssaczego testu 2-hybrydowego poprawiono przez podstawienie systemu reporterowego CAT bardziej czułym konstruktem reporterowym lucyferazy pGAL-TK-LUX dostarczonym przez J. Li (Dział Onkovirology, The Scripps Research Institute). Plazmid pGAL-TK-LUX zawiera sekwencję kodującą lucyferazę pod kontrolą minimalnego promotora TK i 5 kopii miejsca wiążącego DNA GAL4. Plazmidy pM-60 i pVP-75 kotransfekowano pGAL-TK-LUX do komórek COS-7 przy użyciu środka transfekującego DOTAP (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Indiana, USA). Po całonocnej inkubacji, transfekowane komórki zebrano i lizaty komórkowe analizowano pod względem aktywności lucyferazy jak opisano wcześniej (20) w jednostce względnego światła (RLU) przy użyciu luminometru Monolight 2010 przez Analytical Luminescence Laboratory (San Diego, Kalifornia, USA). Plazmidy kontrolne z CLONTECH zostały uwzględnione osobno lub połączone odpowiednio. Kontrola pozytywna obejmuje kodowanie białka fuzyjnego pM3-VP16 z GAL4-DB i VP16 AD, pM-53 kodującego GAL4-DB połączonego z p53 i pVP-T kodującego VP16 AD połączonego z dużym antygenem T SV40. Kontrole negatywne obejmują pusty wektor pM i pVP16 i pVP-CP kodujący wirusowe białko płaszcza. Chemiczne sieciowanie SS-A / Ro i pp75. Komórki HeLa hodowano jako pojedynczą warstwę w podłożu do hodowli DMEM zawierającym 10% FCS, oddzielono od kolby hodowlanej, stosując trypsynę / EDTA (GIBCO BRL, Grand Island, Nowy Jork, USA), przemyto DMEM bez surowicy 2 razy i raz w buforze zawierającym 20 mM HEPES (pH 7,2), 10 mM MgCl2 i 250 mM sacharozy. Komórki zliczano, dzielono na równe dawki po 6,25 x 105 i przenoszono do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Po odwirowaniu peletki komórek ponownie zawieszono w 50. L 1X buforze do lizy (150 mM NaCl, 30 mM Tris-HCl [pH 7,5], 1% Nonidet P-40 i 1,2% inhibitor proteazy zawierający glicerol bez EDTA [Boehringer Mannheim Corp .]). Lizaty komórkowe odpowiadające 6,25 x 105 komórek zastosowano w reakcjach sieciowania, stosując 1, 3 lub 10 ul świeżego 25 mM roztworu DTSSP (3,3a-ditiobis [sulfosukcynimidopropionian], Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). Reakcje sieciowania przeprowadzono na lodzie na 2 godziny przed hartowaniem przez dodanie 2.5 .l M Tris-HCl (pH 7,5). Usieciowane lizaty komórkowe początkowo analizowano za pomocą immunoblotu, a następnie jako substratu w immunoprecypitacji stosując ludzkie przeciwciało anty-SS-A / Ro, a następnie analizę immunoblotów immunoprecypitatów stosując królicze przeciwciało anty-pp75 (patrz dalej). Produkt translacji in vitro i rekombinowane białko. cDNA subklonowane do plazmidów pBluescript (Stratagene) lub pET28 (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) wykorzystano jako matryce DNA do translacji in vitro z sprzężonymi z TnT układami lizatu retikulocytów (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) w obecności [35S] metionina. Produkty translacji analizowano za pomocą 15% żelu SDS-poliakrylamidowego, oglądanego po autoradiografii i stosowanego jako substrat antygenowy w immunoprecypitacji, jak opisano wcześniej (21, 22). Oznaczanie komórek i immunoprecypitacja
[więcej w: olx radziejów, zapalenie ucha u dziecka objawy, zakrzepica leczenie ]