lekarz proktolog sosnowiec

Użyliśmy elektrod jonoselektywnych (ISE) do zapisywania elektrolitów w oocytach w obecności ouabain i bumetanidu, które blokują transfer kationów przez inne transportery (patrz Metody). Oocyty, którym wstrzyknięto zmutowane cRNA, znacznie zwiększyły [Na +] i zmniejszyły [K +] i w porównaniu z tymi, którym wstrzyknięto cRNA WT lub H2O (Figura 3, C i D). Następnie przeprowadziliśmy pomiary strumienia 86Rb + w obecności ouabain i bumetanidu, aby potwierdzić wyciek potasu w bezpośrednim eksperymencie dynamicznym. Jak oczekiwano, wychwyt 86Rb + był znacząco zwiększony dla oocytów, którym wstrzyknięto zmutowane cRNA w porównaniu z tymi, którym wstrzyknięto cRNA WT lub H2O (Figura 3E). W erytrocytach od 3 z 4 pacjentów przepływ 86Rb + był około 6-krotnie zwiększony w porównaniu z 11 normalnymi kontrolami (Figura 3F). Wszystkie te różnice wystąpiły przy braku glukozy, co sugeruje trwały wyciek jednowartościowego kationu zmutowanego transportera, niezależnie od funkcji transportu glukozy. Zostało to potwierdzone przez inkubację erytrocytów od pacjentów i kontroli z 0 lub 15 mM glukozy przez 2 godziny, co nie miało wpływu na zmiany wewnątrzkomórkowego stężenia elektrolitów (patrz Tabela dodatkowa 2). Aby dodatkowo scharakteryzować przewodność wycieku indukowaną przez mutację, przeprowadziliśmy dodatkowe eksperymenty elektrofizjologiczne z natywnymi erytrocytami od 3 pacjentów z rodzinnych PED1 i 3 normalnych kontroli. Zgodnie z naszymi wynikami w oocytach, przewodność całej komórki była istotnie zwiększona u pacjentów. erytrocyty (kontrole, 83 – 16 pS, n = 4, pacjenci, 363 – 12 pS, n = 6 pS, P <0,05, Figura 4, A (D)). Bardzo stabilne warunki zapisu pozwoliły na wielokrotną wymianę roztworów, ujawniając przepuszczalność zmutowanego transportera dla K +> Na +> Ca2 +> n-metylo-d-glukaminy + (NMDG +), ponieważ potencjał odwrócenia przesunięto coraz bardziej w kierunku hiperpolaryzacji, a całość spadły prądy wewnętrzne w tej kolejności (ryc. 4D). Aby potwierdzić zwiększoną przepuszczalność Ca2 + zmutowanego transportera, określiliśmy stężenie cytozolu Ca2 + wolne od erytrocytów ([Ca2 +] i) za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluo3 jako wrażliwego na Ca2 + barwnika. W stanie stacjonarnym pacjenci. erytrocyty wykazywały znacznie wyższą intensywność fluorescencji fluo3 niż kontrolne (7,6 . 0,5 vs. 6,0. 0,3 względne jednostki fluorescencji; n = 18. 19; P <0,02; Figura 4E), co wskazuje na zwiększenie [Ca2 +]. Zastosowanie protokołu zubożenia / uzupełniania Ca2 + (Ryc. 4, F i G) wykazało znacznie szybsze zwiększenie intensywności fluorescencji fluo3 u pacjentów. erytrocyty sugerujące wyższy wyciek Ca2 + nadawany przez zmutowany transporter. Figura 4Funkcjonalna analiza wycieku kationów w erytrocytach od pacjentów z PED1 rodziny. (A i B) Reprezentatywne ślady prądu w całej komórce zarejestrowane z erytrocytów kontrolnej (A) i pacjenta (B) z Na-glukonianem w pipecie i NaCl w roztworze kąpielowym (lewy panel) i po izoosmotycznej zamianie NaCl na chlorek n-metylo-d-glukaminy (NMDG-Cl) w kąpieli (prawy panel). (C i D) Średnie zależności prąd-napięcie (IV) (. SEM) dla kontroli (C) (n = 3. 4) i pacjentów. erytrocyty (D) (n = 5. 6) zarejestrowane jak w A i B z roztworem do kąpieli NaCl (puste kółka) i po izoosmotycznym zastąpieniu NaCl przez NMDG-Cl (zamknięte trójkąty), CaCl2 (otwarte romby) lub KCl (otwarte trójkąty) w kąpieli. W pacjentach. erytrocyty (D), potencjał odwrócenia krzywej IV przesunięty o. 30. 4, 20. 2 i +11. 2 mV (średnia . SEM; n = 5. 6) od tej zarejestrowanej w roztworze NaCl po podstawieniu odpowiednio NMDG-Cl, CaCl2 i KCl. (E) Histogram zarejestrowany za pomocą cytometrii przepływowej w erytrocytach z kontrolnych (czarna linia) i pacjentów (czerwona linia) inkubowanych w roztworze NaCl zawierającym Ca2 +, przedstawiającym intensywność fluorescencji fluo3 jako miarę stanu stacjonarnego wewnątrzkomórkowego ([Ca2 +] i) [podobne: zapalenie ucha u dziecka objawy, windbot skrypty, zaburzenie afektywne dwubiegunowe ]