odtrucie alkoholowe pruszków

Aby wykluczyć potencjalny artefakt związany z układem 2-hybrydowym, poszukiwano niezależnych dowodów na interakcję pp75 i 60-kDa SS-A / Ro. Postulowano, że oddziaływanie związku SS-A / Ro 60 kDa z pp75 jest przejściowe, ale może być stabilizowane chemiczną reakcją sieciowania. DTSSP wybrano jako środek sieciujący, ponieważ jest on związkiem rozpuszczalnym w wodzie, a usieciowany produkt można rozszczepić w obecności a-merkaptoetanolu w denaturującej SDS-PAGE. Figura 4 pokazuje reprezentatywne wyniki sieciowania z zastosowaniem różnej ilości DTSSP i wynikających z tego efektów na antygenowość pp75 i jej powiązanie z SS-A / Ro. Uzasadnienie stosowania 3 rosnących stężeń DTSSP było oparte na wstępnych doświadczeniach miareczkowania środka sieciującego, wykazujących, że nadmierne sieciowanie niszczy epitopy rozpoznawane przez królicze przeciwciała anty-pp75. Pokazano to na Fig. 4, ścieżki 1-4, pokazujące, że reaktywność królika anty-pp75 została znacząco zmniejszona, gdy dodano 3 lub 10. L DTSSP (Figura 4, ścieżki 3 i 4). Gdy usieciowane ekstrakty poddano immunoprecypitacji za pomocą normalnej ludzkiej surowicy lub prototypowej surowicy anty-SS-A / Ro Ge (21, 32), a immunoprecypitaty analizowano na obecność pp75 przy użyciu króliczego przeciwciała w analizie Western, surowica Ge współstrącony pp75 po dodaniu DTSSP (Figura 4, ścieżki 10. 12). Przeciwnie, nie było reaktywności z normalną ludzką surowicą (Figura 4, ścieżki 6. 8) lub z surowicą Ge w nieobecności sieciowania (Figura 4, ścieżka 9). Przeciwciało ge rozpoznało 60-kDa SS-A / Ro i wydawało się wymagać wysokiego stężenia środka sieciującego DTSSP do koimmunoprecypitacji pp75. Ryc. 4Chematyczne sieciowanie SS-A / RO i pp75. Przygotowano świeże lizaty komórek HeLa i sieciowano za pomocą DTSSP, jak opisano w Methods stosując 0, 1, 3 lub 10. L środek sieciujący. Analizę Western blotting z zastosowaniem króliczego przeciwciała anty-pp75 przeprowadzono na samym usieciowanym lizacie (ekstrakty, ścieżki 1-4) lub immunoprecypitatach za pomocą normalnej ludzkiej surowicy (NHS IP, ścieżki 5. 8) lub prototypowej surowicy anty-SS-A / Ro Ge (Ge IP, ścieżki 9. 12). Reaktywność na łańcuch ciężki ludzkiej Ig była przede wszystkim rezultatem krzyżowej reakcji koziego odczynnika wtórnego Ig królika. Wyrażenie komórkowe pp75. Ekspresję pp75 badano w kilku prawidłowych tkankach ludzkich i liniach komórkowych znanych z ekspresji SS-A / Ro o masie 60 kDa. Figura 5a przedstawia wyniki Northern blot do wykrywania mRNA pp75 przy użyciu sondy antysensownego RNA. Pasmo o wadze około 5,0 kb wykryto we wszystkich tkankach z najwyższą ekspresją odnotowaną w sercu. Dodatkowe, o niskiej masie cząsteczkowej prążki 2,9 i 2,0 kb były również obserwowane w niektórych, ale nie we wszystkich tkankach. Silne gatunki o wielkości 2,9 kb obserwowane w trzustce i 2,0 kb RNA w sercu i mięśniu szkieletowym mogą reprezentować produkty z alternatywnym splicingiem, ale nie zbadano tego dalej. Prążków tych nie wykryto, gdy ten sam blot został usunięty i ponownie oczyszczony z mRNA p-aktyny. Figura 5 Ekspresja komórkowego RNA z pp75. (a) Analiza Northern blot mRNA pp75 w prawidłowych tkankach ludzkich. Przeprowadzono hybrydyzację wielu tkankowych blotów z sondą antysensownego RNA dla pp75 (górny panel) i aktyny (dolny panel), jak opisano w Methods. (b) Analiza RT-PCR ludzkiego mRNA pp75 w wybranych ludzkich liniach komórkowych i pierwotnych keratynocytach (NHEK). Kontrolę dla cDNA pp75 i znaczników masy cząsteczkowej (Mr) pokazano po prawej stronie. Łącznie próbki RNA po 10 ng analizowano pod kątem kontroli wewnętrznej GAPDH (dolny panel). Figura 5b przedstawia wyniki analizy RT-PCR dla mRNA pp75 we wszystkich zbadanych liniach komórkowych, w tym w raku płuca SK-LU-1 i Calu-3, prawidłowym ludzkim hodowlanym keratynocytom (NHEK), naskórkowym raku krtani HEp-2, raku sutka T47D, rak pęcherza moczowego T24 i rak nabłonka szyjki macicy HeLa (dane nie przedstawione)
[przypisy: zapalenie okostnej objawy, zespół lyncha, olx bystrzyca kłodzka ]