reumatolog lublin prywatnie

CDNA przejściowo transfekowano do komórek HeLa wysianych na 8-komorowych preparatach (Nalge Nunc International Corp., Naperville, Illinois, USA) stosując środek do transfekcji DOTAP (Boehringer Mannheim Corp.) przez 20 godzin. Komórki utrwalono w oziębionym lodem metanolu-acetonie (objętość 1: 3) przez 2 minuty, wybarwiono mysim mAb na T7Tag (Novagen; 1: 1000) i skoniugowaną z FITC kozią przeciwciałem przeciw mysiej IgG. Podkomórkowe umiejscowienie wyrażonej pp75 obserwowano w mikroskopii fluorescencyjnej. Wyniki Identyfikacja partnera białkowego interakcji 60-kDa SS-A / Ro przy użyciu drożdżowego klonowania 2-hybrydowego. Uzasadnienie wyboru biblioteki cDNA keratynocytu jako początkowego celu, w którym zidentyfikowano potencjalnych partnerów oddziaływania białko-białko 60-kDa SS-A / Ro, oparto na obserwacji, że przeciwciała anty-SS-A / Ro są wysoce związane z 2 chorobami autoimmunologicznymi, podostry skórny toczeń i noworodkowy toczeń, w którym wysypki skórne są głównymi symptomami symptomów. Tabela podsumowuje liczbę klonów na każdym etapie protokołu przesiewowego. Około 1900 000 klonów cDNA kotransformowano z konstruktem przynęty na białko o masie cząsteczkowej 60 kDa do szczepu drożdży YRG-2 naniesionego na pożywkę z potrójnym niedoborem aminokwasu (niedoborem His / Leu / Trp). Wykryto 60 żywych kolonii do 10 dni po wstępnym posianiu. Gdy 60 klonów analizowano pod kątem wytwarzania .-galaktozydazy (produktu genu LacZ) przez inkubację z substratem X-gal, tylko 3 klony dały reakcję w kolorze niebieskim. Plazmidowe DNA ekstrahowano z tych 3 drożdżowych klonów i transformowano do E. coli XL1-Blue przy użyciu selekcji ampicyliną w celu odzyskania tylko docelowych klonów cDNA, ponieważ plazmid przynęty CAM pBD-GAL4 nie wykazuje oporności na ampicylinę. Odzyskany plazmid (białko interakcji [pINP1]) we wszystkich 3 klonach pozytywnych zawierał wspólną wstawkę cDNA o wielkości 2,3 kb, a analiza sekwencji wykazała, że ich wstawki były identyczne. Interakcja między przynętą SS-A / Ro 60 kDa i plazmidem docelowym pINP1 w systemie drożdży została następnie potwierdzona przez ponowną transformację przynęty i plazmidu pINP1 do tego samego szczepu drożdży i wykazanie ich zdolności do ekspresji P-galaktozydazy. Obserwowane oddziaływanie białko-białko było specyficzne, ponieważ pINP1 nie oddziaływuje wzajemnie z plazmidem pAD-GAL4 CAM samym lub z plazmidem przynętowym kodującym białko 52-kDa SS-A / Ro w tym 2-hybrydowym teście drożdżowym. Tabela Podsumowanie drożdżowego 2-hybrydowego sita biblioteki pINP1 koduje częściowy nowy cDNA. Ustalono sekwencję nukleotydową dla pINP1 i zidentyfikowano otwartą ramkę odczytu (rysunek 1a). Analiza sekwencji przy użyciu przeszukiwania BLAST wykazała, że insert cDNA pINP1 był nowy i nie był raportowany w tym czasie (patrz dalej). CDNA pINP1 subklonowano do wektora pET28 w celu wytworzenia rekombinowanego białka w E. coli i stosowano w układzie do translacji in vitro. Zarówno E. coli, jak i system translacji in vitro wytworzyły zrekombinowany polipeptyd o wielkości a29 kDa wykryty w żelu SDS-PAGE. Wykazano, że przeciwciała królika wytwarzane z użyciem rekombinowanego białka 29 kDa jako immunogenu rozpoznają białko o masie 75 kDa w różnych ekstraktach komórkowych (patrz dalej). Dane te sugerują, że pINP1 było częściowym cDNA, które nie ma 5. sekwencja. Pełnej długości pp75. Aby scharakteryzować dalej strukturę i funkcję tego nowego białka 75-kDa, uzyskano 5. cDNA wyższego rzędu przy użyciu obu 5. Metodyka RACE i screening hybrydyzacji biblioteki. Początkowe próby użycia metody RACE miały ograniczony sukces. Najdłuższy cDNA wyprodukował jedynie 145 pz dodatkowych 5. sekwencja w porównaniu z pINP1 (Figura 1). Zasadniczo dłuższy cDNA (pWI38) otrzymano przez przeszukiwanie biblioteki cDNA WI38A ZAPII przy użyciu 2 częściowo komplementarnych syntetycznych oligonukleotydów zaprojektowanych w oparciu o 5. sekwencja wstawki cDNA pINP1
[hasła pokrewne: zakrzepica leczenie, zespół fallota, olx strzelce kraj ]