ropa w nosie u dziecka

Ostatnio okazało się, że sekwencja nukleotydów pWI38 jest zasadniczo identyczna z sekwencją dla klonu cDNA ludzkiego mózgu KIAA0857 (GenBank, nr dostępu AB020664, pozycja 30), który jest dłuższy na obu końcach (Figura 1). KIAA0857 nie był scharakteryzowany, ale oszacowano, że koduje białko większe niż 50 kDa (30). Pełne nukleotydowe i wyprowadzone sekwencje aminokwasowe przedstawiono na Figurze 1b. Istnieją dowody na to, że KIAA0857 koduje cDNA pełnej długości dla pp75. Po pierwsze, pierwszy ATG znaleziono w pozycji nukleotydowej 242 z 5. koniec i doskonale zgadza się z sekwencją konsensusową Kozaka (CCGCCATGG) dla kodonu inicjacji metioniny (31). Po drugie, sekwencja powyżej przypuszczalnego kodonu startu metioniny jest zgodna z regionami nieulegającymi translacji 5 (3, które często są wypełnione domenami bogatymi w GC; 197 z 241 nukleotydów w nieprzekładanym regionie 5 (3 jest GC (81,7% zawartości GC, patrz Figura 1b, gruba warstwa podkreślona). Po trzecie, wyprowadzona otwarta ramka odczytu zawiera 653 aminokwasy z obliczoną masą cząsteczkową 70 kDa w ścisłej zgodności z obserwowaną ruchliwością elektroforetyczną pp75 (patrz dalej). Przypuszczalne białko pp75 o pełnej długości ma stosunkowo wysoki procent reszt seryny (13,94%), co jest zgodne z obserwacją, że jest to fosforylowany polipeptyd (patrz dalej). Analiza przewidywanego polipeptydu wykazała, że istnieje domniemana zależna od cAMP i cGMP kinaza białkowa (n = 3), kinaza białkowa C (n = 8) i miejsca fosforylacji kinazy II (n = 14), chociaż obecnie nie ma dane eksperymentalne potwierdzające, że te kinazy regulują PP75. Białko wydedukowane z cDNA zostało określone jako białko powiązane z SS-A / Ro. 60 kDa pp75, ponieważ białko 75 kDa w lizacie komórek HeLa zostało wykryte przez króliczą surowicę odpornościową przeciwko rekombinowanemu białku za pomocą Western blot (patrz dalej). pp75 skompleksowany z dubletem pp64. Oryginalny cDNA z pINP1 (fragment Bglll) został wklonowany do miejsca BamHI plazmidu ekspresyjnego E. coli pET28c w celu wytworzenia konstruktu pET-INP1. Rekombinowane białko eksprymowane w bakteriach BL21 (DE3) migrowało przy 29 kDa i zostało oczyszczone przez kolumnę powinowactwa z niklem przed immunizacją królików. Analiza Western blot z użyciem surowic od królików R2808 i R2809 wykazała, że główny prążek wykryty w ekstrakcie komórek HeLa wynosił 75 kDa (Figura 2a). W teście immunoprecypitacji z użyciem ekstraktów z komórek HeLa metabolicznie znakowanych fosforanem [32P], surowica po immunizacji z obu królików dała prążek białka 75 kDa i 2 dodatkowe prążki, dublet przy 64 kDa (pp64; Figura 2b). Ponieważ RNA jest związane z białkiem SS-A / Ro o masie 60 kDa, PP75 nie wydaje się być stabilnym składnikiem kompleksu rybonukleoproteiny SS-A / Ro 60-kDa, ponieważ RNA znakowane [32P] nie zostało wykryte w immunoprecypitacja z użyciem królika anti-pp75 (dane nie przedstawione). Prążki pp64 nie reprezentowały gatunków RNA, ponieważ trawienie immunoprecypitatu przez RNazę nie wpływało na te prążki, podczas gdy gatunki RNA związane z SS-A / Ro i SS-B / La zostały usunięte przez to samo traktowanie RNazą. Podsumowując, dane te sugerują, że pp75 jest kompleksowany z dublonem pp64, ponieważ pp64 nie jest bezpośrednio rozpoznawany przez królicze antysurowice anty-pp75 w analizie Western blot. Co ciekawe, z prototypowego zespołu Sjögrena w surowicy zastosowanego w laboratoryjnym immunoprecypitacie dublonu pp64 oprócz SS-B / La w powtarzanych eksperymentach (Figura 2b, ścieżka 5), dostarczając dowodów, że pp64 jest również autoantygenem w SS
[hasła pokrewne: xenobot crack, zespół lyncha, windbot skrypty ]