Sangerowanie sekwencyjne

width=274Wszystkie patogenne warianty, prawdopodobnie patogenne warianty i VUS zostały zweryfikowane przez sekwencjonowanie Sangera. Amplicony kodujące wariant amplifikowano przez PCR z genomowego DNA uzyskanego od dzieci i rodziców i oczyszczono przy użyciu zestawu Axygen AP-GX-50 (nr serii 05915KE1) i zsekwencjonowano sekwencjonowanie Sanger na przyrządzie ABI3730XL.

Doświadczenia z wykorzystaniem wstrzyknięć Morpholino i ratunkowych mRNA

Modyfikowane antygenem morfolino antysensowne oligonukleotydy (GeneTools, po 5 ng na każdą) wstrzykiwano do zarodków w stadium 1-komórkowym do 2-komórkowego. Dla każdego genu zastosowano dwie morfoliny (jedno blokowanie translacji i jedno miejsce docelowe w miejscu splicingu). W eksperymentach ratunkowych, morfolino celujące w miejsce splicingowe (5 ng) zostało wspólnie z ludzkim mRNA dzikiego typu / zmutowanym (200 μg) dla każdego genu.


Obrazowanie fluorescencyjne i ocena fenotypu

Obrazy fluorescencyjne zbierano przy 48 hpf za pomocą mikroskopii konfokalnej jako stosy serii Z i rekonstruowano jako jeden, dwuwymiarowy obraz projekcji o maksymalnej intensywności i film z układem Z. Oceny fenotypowe przeprowadzili dwaj eksperymentatorzy, którzy nie mieli doświadczenia w warunkach eksperymentalnych.
[więcej w: za krótkie wędzidełko, windbot skrypty, zaburzenia somatyczne ]