Zachorowalność na dziedziczny polineuropatologiczny rak jelita grubego i możliwość przeprowadzenia badań molekularnych w kierunku choroby cd

W odrębnym badaniu potwierdzono porównywalność wyników obu metod26. Obecność lub brak błędów replikacji został ustalony przez recenzenta bez wcześniejszej wiedzy o klinicznych cechach pacjentów. Techniką radioaktywną guzy najpierw analizowano za pomocą zestawu siedmiu mikrosatelitarnych markerów (D5S404, D17S787, D5S346, D1S216, D11S904, D10S197 i TP53). Jeżeli DNA nowotworu (w porównaniu z odpowiednim DNA prawidłowej tkanki) jednoznacznie wykazywał nowe allele mikrosatelitarne, odzwierciedlające obecność błędów replikacji, w dwóch lub więcej loci ocenianych przez dwóch recenzentów, guz oceniano jako dodatni pod względem błędów replikacji. Jeżeli dwóch recenzentów nie zgodziło się (jak miało to miejsce w trzech przypadkach), trzeci recenzent ocenił wyniki. Jeśli żaden z markerów nie wyświetlał nowatorskich alleli, guz oceniano jako ujemny pod względem błędów replikacji, pod warunkiem, że co najmniej pięć z siedmiu loci zostało pomyślnie zamplifikowanych. W nielicznych przypadkach, w których tylko locus wykazało nowe allele, użyliśmy dodatkowych markerów (DCC, D13S175, D7S519, D20S100, D15S120, D2S136 i D14S79) do zbadania minimum 10 loci. Jeśli nie uzyskano dodatkowych dowodów na błędy replikacji, guz oceniano jako ujemny. Jeżeli co najmniej jeden dodatkowy marker wykazywał niestabilność, guz oznaczono jako dodatni dla błędów replikacji. Tak więc, w praktyce liczba loci pomyślnie analizowanych metodą radioaktywności wynosiła od 5 do 12 na parę próbek, ale zwykle wynosiła 5 do 7.
W przypadku znakowania fluorescencyjnego i późniejszej analizy fragmentów za pomocą automatycznego sekwensera wszystkie pary próbek bezpośrednio analizowano za pomocą 16 markerów (D8S254, MYC, NM23, D5S346, TP53, D1S228, D8S261, D7S496, D8S137, DCC, D7S501, MCC, D5S318, D1S507 , D19S394 i RB1). Liczba skutecznych amplifikacji mieściła się w zakresie od 7 do 16, ale zwykle wynosiła więcej niż 12. Ze względu na większą liczbę analizowanych markerów, co najmniej 30 procent badanych loci markerowych musiało mieć nowatorskie allele, aby spełnić minimalny wymóg pozytywności dla replikacji. błędy. Gdy wprowadzono tę technikę, amplifikacje były szeroko powtarzane. Ponieważ wyniki były spójne, rutynowe powtarzanie analiz uznano za niepotrzebne. Na koniec, w celu równomiernej weryfikacji statusu błędu replikacji u pacjentów, przeanalizowano całą serię guzów metodą opartą na PCR z użyciem radioaktywnie znakowanego BAT-26, ostatnio wprowadzonego markera mononukleotydowego, który jest szczególnie wrażliwy na błędy replikacji.27,28 Guzy wykazujące allele BAT-26 o co najmniej 7 bp od siebie uważano za niestabilne. Pacjentów zidentyfikowanych jako mających błędy replikacji skontaktowano się i zaoferowano doradztwo genetyczne.
Wykrywanie mutacji
U pacjentów z guzami, w których występowały błędy replikacji, po mutacjach linii germinalnych w MLH1 i MSH2 przeprowadzono dwuwymiarową elektroforezę żelową z gradientem denaturującym w pierwszych 198 pacjentach .9 Czułość tej metody w wykrywaniu mutacji punktowych wynosi od 90 do 100 procent. .30-33 Dla 311 kolejnych pacjentów guzy z błędami replikacji analizowano pod względem mutacji przez bezpośrednie sekwencjonowanie. Regiony promotorowe i każdy ekson genów MLH1 i MSH2 z genomowego DNA były indywidualnie amplifikowane w cyklatorze Perkin-Elmer (model 9600, Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.) 34, a następnie sekwencjonowane bezpośrednio znakowanym fluorescencyjnie M13 do przodu i do tyłu primery (Perkin-Elmer Applied Biosystems Division, Foster City, CA) za pomocą zestawu do sekwencjonowania cyklów primerów Prism (Applied Biosystems) zgodnie z instrukcjami producenta
[przypisy: Choroba Perthesa, alprazolam, belimumab ]
[podobne: olx węgrów, olx bystrzyca kłodzka, zapalenie okostnej objawy ]